Realtime RT-PCR หรือชื่อเต็มว่า “Realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” เป็นเทคนิคในการตรวจโรคหรือตรวจหาการแสดงออก (Expression) ของยีนในเซลล์ เทคนิคนี้ได้รับการต่อยอดมาจากเทคโนโลยี RT-PCR และเทคโนโลยี PCR กล่าวคือ “Realtime” “RT” และ “PCR” นั้นเป็นคนละเทคนิคกัน ก่อนที่จะนำมาใช้ร่วมกัน จึงมีชื่อเต็มว่า Realtime RT-PCR

กุญแจสำคัญอยู่ที่การทำ PCR เพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมในสารตัวอย่างให้มากพอสำหรับการตรวจจับ ส่วน RT หรือ Reverse Transcription เป็นขั้นตอนก่อนการทำ PCR และ Realtime เป็นเทคนิคในการวัดปริมาณของสารพันธุกรรมอย่าง ณ เวลาใดเวลาหนึ่งโดยทันที ซึ่งการทำ PCR แบบปกติจะสามารถวัดปริมาณของสารพันธุกรรมได้เมื่อปฏิกิริยาเสร็จสิ้นแล้วเท่านั้น

Realtime RT-PCR ใช้ Fluorophore ซึ่งจะจับเข้ากับ DNA ใด ๆ ในตัวอย่างเพื่อใช้วัดปริมาณของสารพันธุกรรมในตัวอย่าง

ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่ประกอบไปด้วยสารพันธุกรรมสองประเภทหลัก ๆ ได้แก่ DNA สำหรับเก็บข้อมูลทางพันธุกรรม และ RNA ที่ใช้เป็นตัวกลางในการทำข้อมูลทางพันธุกรรมมาสร้างโปรตีน

ร่างกายของเราอยู่ได้ด้วยกันผลิตโปรตีนและเอนไซม์ต่าง ๆ ออกมาซึ่งมีหน้าที่แตกต่างกัน โปรตีนเป็นเหมือนเครื่องยนต์และชิ้นส่วนกลไกหลากหลายรูปร่างและขนาด โปรตีนแต่ละชนิดจึงมีวิธีผลิตแตกต่างกัน เซลล์วิธีได้เก็บสูตรสร้างโปรตีนเหล่านี้ให้มีความเสถียรด้วย DNA ในส่วนที่เรียกว่า “Coding Sequence (CDS)” ดังนั้น DNA จึงเปรียบเสมือนห้องสมุดขนาดใหญ่ที่เก็บข้อมูลการสร้างโปรตีนทุกชนิดที่ใช้ในร่างกายของเราไว้

ทั้งนี้ ร่างกายมนุษย์มีความซับซ้อนสูง ทุกครั้งที่ร่างกายต้องการใช้โปรตีนใดโปรตีนหนึ่ง แทนที่จะไปค้นห้องสมุดเพื่อหาสูตรผลิตโปรตีน (CDS) ที่ถูกต้องทุกครั้ง เซลล์จะใช้ RNA เป็นตัวกลาง ซึ่งในกระบวนนี้จะใช้ Messenger RNA (mRNA) นำคำสั่งจากนิวเคลียสส่งไปยังหน่วยผลิตโปรตีนภายในเซลล์ การออกคำสั่ง (mRNA) เรียกว่า Transcription เป็นการแปลงรหัสพันธุกรรมจาก DNA ไปเป็น mRNA จากนั้นหน่วยผลิตโปรตีนของเซลล์ที่เรียกว่า Ribosome จะอ่านรหัสพันธุกรรม mRNA แล้วนำกรดอะมิโนแต่ละชนิดมาประกอบโปรตีนตามสูตร

หลักการนี้ในทางชีววิทยาเรียกว่า Central Dogma หมายถึงการส่งผ่านข้อมูลจาก DNA ไปเป็น RNA และจบที่โปรตีน การสร้างโปรตีนจากรหัสใน RNA จะไม่สามารถเกิดย้อนกลับได้แบบตรงไปตรงมา เนื่องจากลำดับกรดอะมิโนเดียวกันอาจเกิดมาจากรหัส RNA ที่ต่างกัน สูตรการสร้างโปรตีนที่เก็บใน DNA ของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิดจึงไม่เหมือนกัน

Polymerase Chain Reaction หรือ PCR เป็นเทคโนโลยีในการขยายปริมาณสารพันธุกรรทในตัวอย่าง

Realtime RT-PCR เป็นวิธีในการทำให้เราเห็นว่า “เซลล์กำลังทำอะไรอยู่” ด้วยการส่องว่าเซลล์กำลังจะผลิตโปรตีนอะไร ผ่านการตรวจจับว่ามี mRNA ของโปรตีนอะไรอยู่บ้าง เช่น หากตรวจพบ mRNA ของโปรตีน A อยู่ในเซลล์ เราก็จะคาดการณ์ได้ว่าเซลล์กำลังจะผลิตโปรตีน A เพราะมีเพียงสูตรสร้างโปรตีนที่กำลังจะทำงานเท่านั้นที่จะอยู่ในรูปของ RNA

ไม่ใช่ว่าทุกคำสั่ง mRNA จะถูกแปลงเป็นโปรตีน เนื่องจากเซลล์มีกลไกเพิ่มเติม หากผลิต mRNA มาแล้วสักพักแต่ไม่มีการนำไปใช้งาน เซลล์จะย่อยสลายทิ้งไป Realtime RT-PCR จะช่วยทำให้เราเห็นการทำงานของเซลล์ ณ ขนาดนั้นเพียงคร่าว ๆ

การทำ Reverse Transcription นั้นใช้แปลง RNA กลับเป็น DNA ซึ่งในที่นี้มักเรียกว่า cDNA

การทำ Realtime RT-PCR เริ่มโดยการสกัด RNA ทั้งหมดในเซลล์ออกมา (Total RNA) ซึ่งจะเป็นการฆ่าเซลล์ไปด้วย โดยทั่วไปแล้ว RNA ในธรรมชาตินั้นมีเสถียรภาพต่ำมาก เพียงทิ้งไว้เฉย ๆ RNA ก็จะสลายไปได้เอง เพราะเอนไซม์ย่อย RNA พบได้ทั่วไปในธรรมชาติ (Ubiquitous RNase) แม้แต่ในน้ำลายหรือเหงื่อเราก็มีเอนไซม์ย่อย RNA เพื่อยับยั้งการแพร่เชื้อของไวรัสบางประเภท

ดังนั้นในการทำ Realtime RT-PCR เราจึงต้องแปลง RNA ให้กลับเป็น DNA ด้วยกระบวนการ Reverse Transcription (RT) เราจะใช้เอนไซม์ Reverse Transcriptase แปลง RNA ที่สกัดได้กลับไปเป็น DNA ในทางชีววิทยาเราจะเรียก DNA ที่ได้จากการแปลงกลับด้วยการทำ RT ว่า cDNA (Complementary DNA) เนื่องจากเป็น DNA ที่ประกอบไปด้วยสูตรผลิตโปรตีนเท่านั้น

cDNA ที่ได้ออกมาจะเปรียบเสมือนชุดคำสั่งที่เซลล์กำลังจะทำตาม ดังนั้นถ้าเราสามารถรู้ได้ว่ามี cDNA ของคำสั่งสร้างโปรตีนอะไรบ้างที่กำลังทำงานอยู่ เราจะสามารถคาดการณ์ได้ว่าเซลล์กำลังจะทำอะไร จากนั้นเรานำ cDNA มาวิเคราะห์ต่อด้วย PCR

ปริมาณ cDNA ที่สังเคราะห์ได้ในช่วงแรกนั้นมีน้อยเกินกว่าจะตรวจสอบได้ จึงต้องใช้เทคนิค PCR มาช่วยเพิ่มจำนวนเสียก่อน เอนไซม์สำคัญในขั้นตอนนี้คือ DNA Polymerase ซึ่งจะนำมาใช้สร้างสำเนา DNA ซ้ำแล้วซ้ำอีกผ่านกระบวนการให้ความร้อนและทำให้เย็นสลับกันเป็นรอบ ๆ แต่ละรอบของ PCR จะทำให้จำนวนสำเนา DNA เพิ่มขึ้นเป็นเท่าตัว เช่น จาก 1 ชุด → 2 ชุด → 4 ชุด → 8 ชุด → 16 ชุด และต่อไปเรื่อย ๆ จนกระทั่งมีปริมาณมากพอที่จะตรวจจับได้

ในการที่เอนไซม์ DNA Polymerase จะสร้าง DNA สายใหม่จากแม่แบบเดิมได้นั้น มันจำเป็นต้องมีจุดเริ่มต้นให้ยึดเกาะก่อน ในกระบวนการ PCR จุดเริ่มต้นนี้ถูกกำหนดโดยไพรเมอร์ (Primer) ซึ่งเป็น DNA สายสั้น ๆ ที่นักวิทยาศาสตร์ออกแบบขึ้นให้มีลำดับพันธุกรรมกับบริเวณที่ต้องการจะเพิ่มจำนวน ไพรเมอร์จะจับกับสายแม่แบบของ DNA จากนั้นเอนไซม์ DNA Polymerase จึงจะเข้ามาต่อเติมลำดับพันธุกรรมตามแนวของสายแม่แบบ ทำให้เกิดการจำลองสาย DNA ใหม่ขึ้นมาได้อย่างแม่นยำ

การเลือกไพรเมอร์จึงเป็นขั้นตอนสำคัญมาก เพราะจะเป็นตัวกำหนดว่าปฏิกิริยา PCR จะเพิ่มจำนวนชิ้นส่วนของสารพันธุกรรมส่วนใด หากออกแบบไพรเมอร์ไม่ตรงกับลำดับที่ต้องการ ปฏิกิริยาก็จะไม่เกิดหรือให้ผลลัพธ์ผิดพลาดได้ ในการตรวจจับหาไวรัส ไพรเมอร์หรือสายรหัสพันธุกรรมที่ตรงกับไวรัสนั้น ๆ จึงใช้เป็นตัวต้นแบบในการตรวจจับนั่นเอง

อย่างไรก็ตาม PCR แบบดั้งเดิมนั้น เราจะเห็นผลได้ก็ต่อเมื่อปฏิกิริยาเสร็จสมบูรณ์แล้วเท่านั้น คล้ายกับการรอให้เครื่องถ่ายเอกสารทำงานจนเสร็จสิ้นก่อนจึงจะรู้ว่าถ่ายสำเนาได้กี่แผ่น เราไม่สามารถรู้ได้ระหว่างทางว่าทำสำเนาเอกสารไปถึงไหนแล้ว เทคนิค Quantitative PCR หรือการทำ PCR เชิงปริมาณ (qPCR) ได้เพิ่มเทคโนโลยีตรวจจับแสงเรือง (Fluorescence Detection) เข้าไปในระหว่างการเพิ่มจำนวน DNA แต่ละรอบ ทำให้เราสามารถมองเห็นปริมาณของ DNA ที่ถูกสร้างขึ้นได้ หรือพูดอีกอย่างคือเราไม่ต้องรอให้การถ่ายเอกสารเสร็จจึงจะเห็นผล แต่สามารถดูจำนวนแผ่นที่ออกมาได้ระหว่างถ่ายเอกสารเลย

ไวรัสเพิ่มปริมาณตัวเองด้วยการขโมยกลไกการสร้างโปรตีนของเซลล์มาใช้ในการผลิตตัวมันเองแทน ทั้งนี้ผ่านการฉีดสารพันธุกรรมของตัวมันเองให้กลไกของเซลล์ผลิต เราจึงสามารถตรวจจับสารพันธุกรรมของมันได้ในเซลล์เราหากเกิดการ

ทุกครั้งที่มีการสร้าง DNA ใหม่ในแต่ละรอบ จะมีสารเรืองแสงชนิดหนึ่ง เช่น SYBR Green หรือ Probe แบบ TaqMan ไว้จับกับสาย DNA ที่ถูกสร้างขึ้น เมื่อจับได้ มันจะเรืองแสงออกมาในระดับที่สัมพันธ์กับปริมาณ DNA ที่มีอยู่ ระบบตรวจวัดของเครื่อง Realtime qPCR จะยิงแสงและตรวจจับความเข้มของสัญญาณเรืองแสงนั้น ทำให้เราสามารถวัดได้ว่าในแต่ละรอบมี DNA เพิ่มขึ้นเท่าใด

เราจึงสามารถสร้างกราฟออกมาได้ที่เรียกว่า “Amplification Curve” ซึ่งกราฟนี้จะบอกให้เรารู้ว่า ตัวอย่างใดมีปริมาณสารพันธุกรรมเริ่มต้นมากหรือน้อย เช่น ถ้ามี mRNA ของไวรัสในตัวอย่างมาก สัญญาณเรืองแสงจะเริ่มพุ่งเร็วตั้งแต่รอบแรก ๆ ของการขยาย แต่ถ้ามีน้อย สัญญาณจะเริ่มเพิ่มขึ้นช้ากว่า การเปรียบเทียบเวลาที่สัญญาณข้ามค่ากำหนด (Threshold Cycle หรือ Ct Value) จึงกลายเป็นหัวใจของการวิเคราะห์ในเทคโนโลยี Realtime qPCR

กราฟ Amplification Curve จากการทำ Realtime RT-PCR ซึ่งบ่งบอกค่า Ct หรือจุดที่ปริมาณของสารพันธุกรรมถึง Threshold

เมื่อไวรัสเข้าสู่ร่างกาย มันจะมองหาเซลล์ที่เหมาะสมเพื่อใช้เป็นโรงงานผลิตของมัน โดยการเกาะเข้ากับผิวเซลล์ผ่านโปรตีนเฉพาะ แล้วฉีดสารพันธุกรรมของตัวเองเข้าไปในเซลล์นั้นซึ่งอาจเป็น DNA หรือ RNA ก็ได้ ทั้งนี้ทั้งสองจะมีกลไกในการสร้างตัวเองแตกต่างกัน จากนั้นไวรัสจะยึดระบบการทำงานของเซลล์ ซึ่งในที่นี้มักจะเป็น Ribosome ที่มีหน้าที่ผลิตโปรตีน เพื่อให้เซลล์เริ่มผลิตส่วนประกอบของไวรัสแทนที่จะผลิตโปรตีนของตัวเอง กล่าวคือ เซลล์จะถูกหลอกให้สร้างโปรตีนไวรัสออกมาแทน และเมื่อโปรตีนไวรัสและสารพันธุกรรมถูกสร้างครบ ก็จะประกอบกันเป็นไวรัสตัวใหม่ ๆ พร้อมแพร่กระจายไปติดเซลล์อื่น

เนื่องจากไวรัสหลายชนิด เช่น ไวรัส SARS-CoV-2 ที่ก่อให้เกิดโรค COVID-19 หรือไวรัสไข้หวัดใหญ่ ใช้ RNA เป็นสารพันธุกรรมหลัก นักวิทยาศาสตร์จึงใช้เทคนิค Realtime RT-PCR มาตรวจจับการติดเชื้อไวรัสเหล่านี้ในตัวอย่างจากผู้ป่วย เช่น สารคัดหลั่งจากโพรงจมูกหรือลำคอ

กระบวนการตรวจทำงานโดยเริ่มจากการสกัด RNA ทั้งหมดออกจากตัวอย่าง ซึ่งหากมีไวรัสอยู่ RNA ของไวรัสก็จะถูกรวมมาด้วย จากนั้น RNA จะถูกแปลงกลับเป็น DNA ด้วยกระบวนการ Reverse Transcription เพื่อให้สามารถเพิ่มจำนวนต่อด้วย PCR ได้ ในขั้นตอนของ Realtime qPCR เครื่องจะเพิ่มจำนวน DNA ของไวรัส (ซึ่งได้จาก RNA เดิมจากการทำ Reverse Transcription) ทีละรอบพร้อมกับตรวจวัดสัญญาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์ หากตัวอย่างมีไวรัสอยู่จริง ปริมาณสารพันธุกรรมของไวรัสจะเพิ่มขึ้นตามรอบการขยาย และสัญญาณเรืองแสงก็จะพุ่งขึ้นบนกราฟ Amplification Curve ให้เห็นอย่างชัดเจน

โดยหลักการแล้ว ถ้าปริมาณไวรัสในตัวอย่างมีมาก สัญญาณจะปรากฏขึ้นเร็ว (ค่า Ct ต่ำ) แต่ถ้ามีไวรัสน้อย สัญญาณจะช้ากว่า (ค่า Ct สูงกว่า) ดังนั้น Realtime RT-qPCR จึงไม่เพียงบอกได้ว่าผู้ป่วย “ติดเชื้อหรือไม่” แต่ยังสามารถบ่งบอกเชิงปริมาณได้ว่า “มีไวรัสมากน้อยเพียงใด”

เรียบเรียงโดย
โชติทิวัตถ์ จิตต์ประสงค์
ภาควิชาศัลยศาสตร์ออร์โธปิดิกส์และการบาดเจ็บ
คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัย The Chinese University of Hong Kong

อัปเดตข้อมูลแวดวงวิทยาศาสตร์ เทคโนโลยี รู้ทันโลกไอที และโซเชียลฯ ในรูปแบบ Audio จาก AI เสียงผู้ประกาศของไทยพีบีเอส ได้ที่ Thai PBS

“รอบรู้ ดูกระแส ก้าวทันโลก” ไปกับ Thai PBS Sci & Tech

สรุปประเด็นให้โดย Generative AI

เทคโนโลยี Realtime RT-PCR ทำไมจึงสำคัญในด้านการตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อ